La centrifugación diferenciada es un procedimiento común en la microbiología y citología usada para separar ciertos organelos de las células enteras para el análisis adicional de partes específicas de células. En el proceso, una muestra del tejido es primer homogeneizado para romper las membranas celulares y para mezclar para arriba el contenido de célula. El homogenado entonces se sujeta a las centrifugaciones repetidas que quitan la pelotilla y que aumentan cada vez la fuerza centrífuga . Finalmente, la purificación se puede hacer con la sedimentación del equilibrio, y la capa deseada se extrae para el análisis adicional.

La separación se basa en tamaño y densidad, con partículas más grandes y más densas granulando en fuerzas centrífugas más bajas. Como ejemplo, las células enteras intactas granularán a las velocidades bajas y a los intervalos cortos tales como 1,000g por 5 minutos. Considerando que es pequeño sigue habiendo en el flotante y requiere los fragmentos y los organelos de la célula más fuerza y mayores épocas de granular. Uno puede enriquecer generalmente para los componentes siguientes de la célula, en la orden de separación en el uso real:
Células y núcleos enteros;
Mitocondrias, lisosomas y peroxisomes;
Microsomas (vesículas del retículo endoplásmico interrumpido); y
Ribosomas y cytosol.

Preparación de la muestra

considera también:

la homogeneización

Antes de que la centrifugación diferenciada se pueda realizar para separar diversas porciones de una célula a partir de la una otras, la muestra de tejido debe primero ser homogeneizada. En este proceso, se utiliza un mezclador, generalmente un pedazo de la porcelana porosa de la misma forma y la dimensión que el envase. El envase es, en la mayoría de los casos, un tubo de ebullición de cristal.

La muestra de tejido primero se machaca y una solución tampón se agrega a ella, formando una suspensión líquida de la muestra de tejido machacada. La solución tampón es un denso, inerte, la solución acuosa que se diseña para suspender la muestra en un medio líquido sin el daño de él con las reacciones químicas o la ósmosis . En la mayoría de los casos, la solución usada es solución de la sucrosa ; en cierta salmuera de los casos será utilizado. Entonces, el mezclador, conectado con un rotor de alta velocidad, se inserta en el envase que sostiene la muestra, presionando la muestra machacada contra la pared del envase.

Con el rotor girado, la muestra de tejido es molida por los poros de la porcelana y la pared del envase en fragmentos minúsculos. Este proceso de pulido romperá las membranas celulares de las células de muestra, saliendo de los organelos individuales suspendidos en la solución. Este proceso se llama homogeneización. Seguirá habiendo las células de una porción intacto después de moler y algunos organelos serán dañados, y éstos serán abastecidos en el estado avanzado de centrifugación.

Ultracentrifugación

La muestra homogeneizada está lista ahora para la centrifugación en una ultracentrifugadora . Una ultracentrifugadora consiste en un compartimiento refrigerado, evacuado que contiene un rotor que sea conducido por un motor eléctrico capaz de la rotación de alta velocidad. Las muestras se colocan en tubos dentro o se atan al rotor. La velocidad rotatoria puede alcance alrededor de 70.000 RPM, creando fuerzas centrífugas de la velocidad de 500,000g. Esta fuerza causa la sedimentación de macromoléculas, y puede incluso causar distribuciones no uniformes de pequeñas moléculas.

Puesto que diversos fragmentos de una célula tienen diversos tamaños y densidades, cada fragmento colocará en una pelotilla con diversas fuerzas centrífugas mínimas. Así, la separación de la muestra en diversas capas puede ser hecha primero centrifugando el homogenado original bajo fuerzas débiles, quitando la pelotilla, entonces exponiendo los supernatants subsecuentes a campos centrífugos secuencialmente mayores. Cada vez que una porción de diversa densidad se sedimenta a la parte inferior del envase y se extrae, y el uso repetido produce una fila de capas que incluya diversas partes de la muestra original. Las medidas adicionales se pueden tomar para refinar más lejos cada uno de las pelotillas obtenidas.

La sedimentación depende de masa, de forma, y del volumen específico parcial de una macromolécula, así como densidad, tamaño del rotor y el índice solventes de rotación. La velocidad de la sedimentación se puede supervisar durante el experimento para calcular el peso molecular . Los valores del coeficiente de la sedimentación (s) pueden ser calculados. Los valores grandes de S (una tarifa de sedimentación más rápida) corresponden a un peso molecular más grande. La partícula densa sedimenta más rápido. Las proteínas alargadas tienen coeficientes friccionales más grandes, y sedimentan más lentamente.

Sedimentación (isopícnica) del equilibrio

¡la información en el artículo correcto --> artículo principal del : Centrifugación isopícnica

La sedimentación del equilibrio del utiliza un gradiente de una solución tal como cloruro o sucrosa del cesio para separar las partículas basadas en sus densidades individuales (masa/volumen). Se utiliza como un proceso de la purificación para la centrifugación diferenciada. Una solución se prepara con la porción más densa del gradiente en la parte inferior. Las partículas que se separarán después se agregan al gradiente y se centrifugan. Cada partícula procede (cualquiera hacia arriba o hacia abajo) hasta que alcance un ambiente de la densidad comparable. Tal gradiente de densidad puede ser continuo o preparado de una manera caminada. Por ejemplo, al usar la sucrosa para preparar gradientes de densidad, uno puede flotar cuidadosamente una solución de la sucrosa del 40% sobre una capa de sucrosa del 45% y agregar más lejos capas menos densas arriba. El homogenado, preparado en un almacenador intermediario diluído y centrifugado breve para quitar el tejido y las células intactas, entonces se acoda en tapa. Después de la centrifugación típicamente por una hora aproximadamente 100.000 x g, uno puede observar los discos de los componentes celulares que residen en el cambio en densidad a partir de una capa al siguiente. Cuidadosamente ajustando las densidades de la capa para emparejar el tipo de la célula, uno puede enriquecer para los componentes celulares específicos. El cloruro del cesio permite la mayor precisión en la separación de partículas de la densidad similar. De hecho, con un gradiente del cloruro del cesio, las partículas de la DNA que han incorporado los isótopos pesados (13C o 15N por ejemplo) se pueden separar de partículas de la DNA sin los isótopos pesados.

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